Khoa học công nghệ ngành Công Thương

Thứ sáu, 29/03/2024 | 20:26

Thứ sáu, 29/03/2024 | 20:26

Kết quả nhiệm vụ KHCN

Cập nhật lúc 22:01 ngày 16/03/2020

Bước đầu hoàn thiện quy trình bảo quản sinh trưởng chậm nguồn gen cây thuốc lá bằng phương pháp Invitro

TÓM TẮT
Lưu giữ nguồn gen thuốc lá là nhiệm vụ thường xuyên được Viện Thuốc lá thực hiện với hai phương pháp là bảo quản sinh trưởng chậm và bảo quản hạt trung hạn. Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp để lưu giữ nguồn gen bằng phương pháp bảo quản sinh trưởng chậm nhằm đạt các tiêu chí là lưu giữ nguyên trạng số lượng, chất lượng nguồn gen, đạt tốc độ sinh trưởng chậm, giảm chu kỳ nuôi cấy và tăng cường hiệu quả lưu giữ nguồn gen thuốc lá đã được triển khai trong năm 2018-2019. Kết quả bước đầu cho thấy môi trường MS (pH= 5,6-5,8), nồng độ agar 1%, bổ sung sucrose 6% hoặc D-mannitol 2% ở điều kiện nhiệt độ 20 ± 20C có tác dụng làm cây thuốc lá sinh trưởng chậm về chiều cao cây, độ dài lá đồng thời đảm bảo chất lượng cây cao nhất khi bảo quản sinh trưởng chậm.
 I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuốc lá (Nicotiana spp.) là một trong những cây trồng phi thực phẩm thuộc họ cà (Solanaceae) được trồng thương mại rộng rãi trên toàn thế giới (Moon và cộng sự, 2009) [5]. Chi thuốc lá có trên 64 loài, trong đó, loài Nicotiana tabaccum được trồng nhiều nhất. Thuốc lá có một số dạng khác nhau, được phân biệt dựa theo các tiêu chí như phương pháp sấy (thuốc lá vàng sấy lò, hong gió, phơi nắng, sấy lửa...) hoặc theo các đặc điểm hình thái và sinh hóa (thuốc lá thơm, thuốc lá sáng màu, thuốc lá Burley, thuốc lá phương Đông) (Ren, Timko, 2001) [6]. Lưu giữ nguồn gen cây thuốc lá nhằm tránh xói mòn nguồn gen, tạo nguồn vật liệu khởi đầu phong phú để thực hiện các mục tiêu nghiên cứu khoa học, đào tạo, phát triển nguồn gen và trao đổi nguồn gen quốc tế là nhiệm vụ thường xuyên được thực hiện tại Viện Thuốc lá. Nghiên cứu ứng dụng một số yếu tố kỹ thuật nhằm tăng cường hiệu quả lưu giữ nguồn gen cây thuốc lá được triển khai, trong đó nội dung nghiên cứu xác định một số yếu tố làm tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường bảo quản sinh trưởng chậm là nội dung khá quan trọng.
Dưới đây là một số kết quả của nội dung nghiên cứu này.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu:
Vật liệu nghiên cứu gồm những cây thuốc lá invitro chất lượng tốt, sạch bệnh, không có lá úa vàng, có nguồn gốc từ phòng nuôi cấy mô thuộc thuốc lá (nguồn gen C254 và Heivesi1).
2.2. Phương pháp nghiên cứu:
- Cây thuốc lá của các nguồn gen đang được bảo quản trong ống nghiệm có chất lượng tốt, sạch bệnh, có nguồn gốc từ phòng nuôi cấy mô của Viện Thuốc lá, chiều cao từ 8 - 10 cm được sử dụng làm vật liệu ban đầu. Dùng pank lấy mẫu ra khỏi ống nghiệm, cắt bỏ đốt ngọn, đốt sát gốc và lá, sau đó cắt đoạn thân thành những đoạn có chứa một chồi bên, cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy thí nghiệm. Xác định môi trường thích hợp cho bảo quản sinh trưởng chậm nguồn gen cây thông qua các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ agar, nồng độ D-mannitol và sucrose đến khả năng bảo quản sinh trưởng chậm nguồn gen thuốc lá trong các thời điểm khác nhau của chu kỳ bảo quản mẫu.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ agar đến khả năng phát triển của cây thuốc lá invitro: gồm 3 nồng độ agar (CT1-0,8%, CT2-1% và CT3- 1,2%), bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 lần nhắc lại, 10 cây/lần nhắc lại.
- Nghiên cửu ảnh hưởng của nồng độ D-mannitol đến khả năng phát triển của cây invitro: gồm 6 nồng độ D-mannitol (CTĐC, DM1-1%, DM2- 2%,, DM3-3%, DM4-6% và DM5-9%), trong môi trường MS (agar 1%), bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 lần nhắc lại, 10 cây/lần nhắc.
- Nghiên cửu ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng phát triển của cây invitro: gồm 5 nồng độ sucrose (CTĐC-3%, DS1-4%, DS1-5%, DS1-6% DS1-9%), trong môi trường MS (agar 1%), bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 lần nhắc lại, 10cây/lần nhắc.
- Phương pháp xác định môi trường thích hợp trong lưu giữ bảo quản sinh trưởng chậm: Xác định được công thức đồng thời đạt các tiêu chí: chiều cao cây, kích thước lá và số lá thấp nhất, chất lượng cây đạt từ trung bình đến tốt sau 10 tuần nuôi cấy.
- Quy định thang đánh giá chất lượng cây trong ống nghiệm sau 10 - 12 tuần cấy:
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ agar đến khả năng phát triển của nguồn gen thuốc lá C254 trong môi trường bảo quản sinh trưởng chậm
+++: tốt: tỷ lệ ra rễ > 90%, lá màu xanh, dài lá>6cm, lá cân đối, chiều cao cây >7 cm, thân cây cứng cáp, rễ nhiều.
++: trung bình: tỷ lệ ra rễ > 80%, lá màu xanh vàng, xanh nhạt, dài lá từ 4-6 cm, lá cân đối, chiều cao cây từ 4-7 cm, thân cây cứng cáp, rễ trung bình.
+: kém: tỷ lệ ra rễ trên < 80%, lá xanh rất đậm hoặc ngả sang vàng, dài lá dưới 4 cm, lá phát triển không cân đối, cao cây dưới 4cm, ít rễ, rễ bị chùn.
- Số liệu được xử lý trong phần mềm Statistix 8.2
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Ảnh hưởng của nồng độ agar đến khả năng phát triển của cây thuốc lá invitro
Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏ-Rhodophyta), có tác dụng tạo dạng rắn (solid) và dạng sệt (semi-solid) trong môi trường nuôi cấy invitro. Agar có đặc tính không phản ứng với các thành phần của môi trường, không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật, duy trì sự ổn định ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy. Ở 800C, agar ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 400C trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar cao từ 6 - 12 g/l. Bình thường, agar được dùng trong môi trường để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Hiện tại, Viện Thuốc lá đang lưu giữ cây invitro trong môi trường MS cơ bản với nồng độ agar là 0,8% (tương ứng là 8g/l). Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ agar đến khả năng phát triển cây thuốc lá invitro, đề tài đã thử nghiệm 3 công thức thí nghiệm với 3 nồng độ agar là 0,8%, 1% và 1,2% trên nền môi trường MS, nguồn gen C254. Một số kết quả chính được thể hiện trong Bảng 3.1 cho thấy:
Tỷ lệ (TL) cây ra rễ giảm ở cả hai nồng độ agar 1-1,2% (tương ứng là 87 và 76%) so với CTĐC (90%).
Chất lượng cây ở nồng độ agar 1% đạt trung bình và tương đương với đối chứng (++), ở nồng độ agar 1,2% cây có chất lượng kém (+). Như vậy, khi tăng nồng độ agar đến 1,2% có xu hướng làm giảm chất lượng cây.
Chiều cao cây ở cả hai nồng độ agar 1 và 1,2% đều thấp hơn so với CTĐC (tương ứng là 9,5; 9,1 và 10,9 cm). Như vậy, khi tăng nồng độ agar trong môi trường MS từ 1 đến 1,2% có tác dụng làm giảm chiều cao cây.
Chiều dài lá lớn nhất ở cả hai nồng độ agar 1 và 1,2% đều ngắn hơn so với CTĐC (tương ứng là 7,3; 6,8 và 8,1 cm).
Tổng số lá và chiều rộng lá của ở cả hai nồng độ agar 1 và 1,2% tương đương với CTĐC.
Tổng hợp các chỉ tiêu theo dõi cho thấy, khi tăng nồng độ agar từ 1-1,2% trong môi trường MS làm giảm chiều cao cây, giảm chiều dài lá, giảm tỷ lệ cây ra rễ nhưng không ảnh hưởng đến tổng số lá và chiều rộng lá. Tuy nhiên, ở nồng độ 1,2%, tỷ lệ ra rễ giảm (đạt 76%), lá gốc vàng, rễ bị xoắn vặn, môi trường cứng khiến thao tác cấy chồi vào môi trường lâu hơn, chồi dễ bị thương tổn do cần lực mạnh để ghim cây vào môi trường nên ảnh hưởng đến chất lượng mẫu cấy ơ lần cấy tiếp theo. Vì thế, bổ sung nồng độ agar 1% là công thức thích hợp để bảo quản sinh trưởng chậm thay thế cho CTĐC đang sử dụng. Môi trường MS, agar 1% được dùng để triển khai các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ D-manitol đến khả năng phát triển của nguồn gen thuốc lá C254 trong môi trường bảo quản sinh trưởng chậm
3.2.      Ảnh hưởng của nồng độ D-manitol trong môi trường bảo quản sinh trưởng chậm
Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đối với thành công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Trong nuôi cấy invitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Manitol là một trong các phân tử lưu trữ năng lượng và carbon có nhiều nhất trong tự nhiên, được sản xuất bởi rất nhiều các vi sinh vật, bao gồm cả vi khuẩn, nấm men, nấm, tảo, địa y và nhiều loài thực vật. D-manitol vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Khi bổ sung mannitol vào môi trường nuôi cấy sẽ có tác dụng làm giảm khả năng hút nước, hút khoáng của bộ rễ và làm giảm tốc độ phân chia của tế bào thực vật. Vì thế mannitol có ý nghĩa rất lớn đối với hoạt động duy trì quỹ gen thực vật qua phương thức bảo quản sinh trưởng chậm (Jarret, Gawel, 1991) [4]. Nhằm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ D-manitol đến sự phát triển của cây thuốc lá trong môi trường bảo quản sinh trưởng chậm, để tài tiến hành thí nghiệm bổ sung một số nồng độ D-manitol trong môi trường MS (nồng độ agar1%). Kết quả nghiên cứu thể hiện trong Bảng 3.2.
TL cây ra rễ TL nghịch với nồng độ D-manitol bổ sung vào môi trường, trong đó, công thức DM1-1%, DM2- 2% có TL cây ra rễ trên trên 80% (tương ứng là 90; 90 và 83%), công thức DM3-3% và DM4-6% có TL cây ra rễ dưới 80% (tương ứng là 60 và 53%); công thức DM5 - 9% chồi không ra rễ, mô chuyển vàng và chết dần.
Chất lượng cây TL nghịch với nồng độ D-manitol, trong đó, chất lượng cây tốt nhất được ghi nhận ở công thức DM1-1%, tốt hơn CTĐC; kém nhất tại công thức DM3-3% và DM4-6%.
Chiều cao cây TL nghịch với nồng độ D-manitol, trong đó, chiều cao cây ở công thức DM1-1% tương đương CTĐC (tương ứng là 9,6 và 9,7cm); các công thức còn lại đều thấp hơn CTĐC, trong đó thấp nhất là công thức DM4- 6% (1,5 cm).
Tổng số lá của công thức DM1-1%, DM2-2% và DM3-3% tương đương nhau (tương ứng là 9,8; 9,7 và 9,7 lá) và cao hơn CTĐC và DM4-6% (9,3 lá).
Chiều dài lá TL nghịch với nồng độ D-manitol, trong đó CT DM1-1% cho chiều dài lá dài nhất (7,8 cm) và DM4-6% có chiều dài lá ngắn nhất (1,1 cm).
Chiều rộng lá TL nghịch với nồng độ D-manitol, trong đó, CTĐC cho chiều rộng lá lớn nhất (2,7 cm) và DM4-6% có chiều rộng lá hẹp nhất (0,8 cm).
Tổng hợp các chỉ tiêu theo dõi cho thấy bổ sung D-manitol nồng độ 2% vào môi trường bảo quản sinh trưởng chậm nguồn gen thuốc lá là phù hợp vì môi trường này có nhiều ưu điểm như TL ra rễ trên 80%, chất lượng cây trung bình, chiều cao cây và kích thước lá nhỏ hơn CTĐC và và đảm bảo chất lượng mẫu cấy cho lần cấy chuyển tiếp theo.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đó của một số tác giả khi nghiên cứu phương pháp bảo quản nguồn gen khác như: Hà Thị Thân (2006) [1], sử dụng môi trường bảo quản MS cơ bản, bổ sung maitol 3% và sorbitol 2% có hiệu quả tốt nhất trong lưu giữ cây khoai tây invitro, Vũ Ngọc Lan và CS (2015) [2], lưu giữ cây khoai môn invitro trong môi trường bảo quản MS + 6g/l agar + 20g/l mannitol; Lê Khả Tường và Nguyễn Thị Hà Phương (2017) [3], môi trường lưu giữ invitro nguồn gen gừng bổ sung D-mannitol với lượng 10g/l, 30g/l sucrose, 6g/l agar, 100mg/l myoinosotol trong môi trường MS, pH=5,6-5,8 ở nhiệt độ 200C là công thức bảo quản hiệu quả.
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose trong môi trường bảo quản sinh trưởng chậm
Saccaroza được bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy để làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường, làm giảm sự hấp thu dinh dưỡng của cây, do đó làm cây chậm sinh trưởng. Đường sucrose là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô với nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%. Đường sucrose vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Sucrose đóng góp khoảng 50-70% vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000) [7]. Vì vậy, điều chỉnh tăng nồng độ đường sucrose vào môi trường MS trong một giới hạn nhất định có tác dụng kìm hãm tốc độ sinh trưởng của cây. Để nghiên cứu hoàn thiện và tối ưu qui trình bảo quản nguồn gen bằng phương pháp sinh trưởng chậm, đề tài đã tiến hành thí nghiệm về nồng độ sucrose bổ sung vào môi trường bảo quản đến sự sinh trưởng phát triển của nguồn gen thuốc lá (Heivesi1). Kết quả nghiên cứu thể hiện trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng phát triển của nguồn gen thuốc lá Heivesi1 trong môi trường bảo quản
Tỷ lệ cây ra rễ TL nghịch với nồng độ sucrose và đều có TL cây ra rễ > 80% (ngoại trừ DS4-9%), đảm bảo yêu cầu.
Chất lượng cây của các công thức DS1-DS3 đạt trung bình và tương đương so với CTĐC, ở công thức DS4- 9% có chất lượng cây kém (+), lá có biểu hiện chuyển vàng sơm, già hóa nhanh.
Chiều cao cây của các công thức DS1-4%, DS2-5% tương đương CTĐC (khoảng 8 cm), DS3-6% và DS4-9% có chiều cao cây nhỏ hơn (tương ứng là 7,0 và 6,5 cm).
Tổng số lá của các CTTN đều nhỏ hơn CTĐC (9,9 lá/cây), trong đó tổng số lá của công thức DS1-4%, DS2-5% và DS3-6% tương đương nhau (tương ứng là 8,9; 8,7 và 8,8 lá/cây) và nhiều hơn công thức DS4-9% (7,5 lá/cây).
Chiều dài và chiều rộng lá của đa số công thức đều nhỏ hơn CTĐC và TL nghịch với nồng độ sucrose bổ sung vào môi trường; trong đó chiều dài - rộng lá lớn nhất là công thức DS1-4% (7,9 x 2,7 cm) và nhỏ nhất là của công thức DS4-9% (5,8 x1,9 cm).
Tổng hợp các chỉ tiêu theo dõi cho thấy công thức bổ sung sucrose với nồng độ 6% vào môi trường bảo quản sinh trưởng chậm nguồn gen cây là phù hợp do môi trường này có nhiều ưu điểm so với môi trường đang sử dụng (MS cơ bản, agar 1%) như TL ra rễ trên 80%, chất lượng cây, chiều cao cây và kích thước lá nhỏ hơn so với CTĐC và đảm bảo chất lượng mẫu cấy cho lần cấy chuyển tiếp theo.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đó của các tác giả Hà Thị Hân (2006) [1], sử dụng môi trường bảo quản MS cơ bản, bổ sung saccaroza 6% có tác dụng làm chậm sinh trưởng khi lưu giữ cây khoai tây invitro, Lê Khả Tường và Nguyễn Thị Hà Phương (2017) [3], môi trường MS với pH = 5,6 - 5,8 bổ sung sucrose lượng 60 g/l trong làm cây gừng đạt tốc độ sinh trưởng chậm nhất về cao cây và số lá đồng thời đảm bảo chất lượng cây cao nhất sau 8 tuần.
IV. KẾT LUẬN
- Môi trường MS, nồng độ agar1%, bổ sung D-manitol nồng độ 2% dung lưu giữ invitro nguồn gen thuốc lá đảm bảo đạt tốc độ sinh trưởng chậm về chiều cao cây, độ dài lá và chất lượng cây cao nhất sau 10 tuần cấy chuyển.
- Môi trường MS, nồng độ agar 1%, bổ sung sucrose với nồng độ 6% pH = 5,6-5,8 ở nhiệt độ 20 ± 20C để lưu giữ invitro nguồn gen thuốc lá đảm bảo đạt tốc độ sinh trưởng chậm về chiều cao cây, độ dài lá và chất lượng cây cao nhất sau 10 tuần cấy chuyển.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hà Thị Hân (2006). Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản in vitro nguồn giống khoai tây sạch bệnh. Luận văn thạc sĩ nông nghiệp.
2. Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Phương Dung, Nguyễn Văn Phú (2015), Lưu giữ invitro nguồn gen khoai môn bản địa. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, tập 13, số 4: 623-633.
3. Lê Khả Tường và Nguyễn Thị Hà Phương (2017). Nghiên cứu xác định môi trường lưu giữ invitro nguồn gen gừng tại ngân hàng gen cây trồng quốc gia. Tạp chí Khoa học nông nghiệp Việt Nam 2017, số 8: 12-15.
4. Jarret RL and Gawel N (1991). Chemical and environmental growth regulation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 2: 153-160.
5. Moon, H.S., J.S. Nicholson, A. Heineman, K. Lion, R. van der Hoeven, A.J. Hayes, and R.S. Lewis., 2009. Changes in genetic diversity of U.S. flue-cured tobacco germplasm over seven decades of cultivar development. Crop Sci. 49:498-508.
6. Ren. N., Timko. M. P. (2001). “AFLP analysis of genetic polymorphism and evolutionary relationships among cultivated and wild Nicotiana species. Genome. v. 44. n. 04. p. 559-571. 2001.
7.  Trigiano G.N. and D.J. Gray (2000). Plant tissue culture concepst and laboatry exercise, CRC Press. Florida, America.
Trần Thị Thanh Hảo, Đinh Bá Mạnh
Viện Thuốc Lá
Theo Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 40/2019
lên đầu trang