Thiết bị lên men khí nâng (air-lift) cho thấy nhiều ưu điểm hơn thiết bị lên men khuấy trộn thông thường trong lên men nấm sợi do có thể giảm năng lượng tiêu thụ, hạn chế tạp nhiễm, hạn chế lực cắt tác động lên hệ sợi. Nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thiết bị lên men khí nâng để sinh tổng hợp sinh khối giàu protein chủng nấm sợi từ dịch hèm của nhà máy cồn nhiên liệu Tùng Lâm. Sau 4 ngày lên men ở 45°C, sinh khối ướt nấm sợi thu được trong thí nghiệm đạt 26,7g/L tương ứng với 4,2g/L sinh khối khô khi sử dụng chủng Rhizomucor miehei FCH116.3. Kết quả này không chỉ nhằm ứng dụng lên men dịch hèm tại nhà máy cồn nhiên liệu mà còn mở ra ứng dụng trong quy trình lên men vi nấm trong các lĩnh vực khác.

Từ khóa: lên men khí nâng (air-lift), dịch hèm, Rhizomucor miehei.

Sinh khối vi sinh vật dùng cho con người, động vật (SCP - single cell protein) đã được sản xuất quy mô lớn từ đầu thế kỷ 20 và nấm men được dùng làm thức ăn cho người trong thế chiến I tại Đức. Tuy nhiên sau đó sản xuất SCP đã không còn được tiếp tục cho tới những năm 1960s và chỉ được thiết lập lại vào những năm 1970 và sử dụng hydrocarbon làm nguyên liệu.

Sau giai đoạn này, những quy trình dựa trên hydrocarbon đã không thể cạnh tranh với các nguồn nguyên liệu thức ăn giàu protein khác. Cho tới những năm 2000, lên men sinh khối nấm sợi sử dụng làm thức ăn cho người đã được chú ý trở lại và đã đạt được một vài thành tựu kinh tế trong xu thế mới [1,8,9].

Khi lên men nấm sợi trên thiết bị khuấy trộn có sục khí, hiện tượng vón cục xảy ra và hệ sợi vón cục dễ bị mắc lại trên cánh khuấy. Lên men khí nâng đã được chứng mình là phù hợp cho sự phát triển của một số vi sinh vật nhờ vào hoạt động đảo trộn nhẹ nhàng bởi dòng khí nâng và tránh được lực cắt và va chạm với cánh khuấy. Một số thiết bị lên men thể tích 1000–2000L đã được thương mại hóa. Celltech Ltd, UK, đã dùng những thiết bị này để lên men tế bào động vật sản xuất kháng thể.

Varley và Birch đã đưa ra một tóm tắt chi tiết về thiết kế và scale-up của lên men sục khí cho lên men tế bào động vật, nhấn mạnh vai trò của cân bằng trong đảo trộn, trao đổi oxy và áp lực.

Ngoài ra do không có cánh khuấy cũng loại trừ đi một nguồn nhiễm tạp tiềm ẩn [2,5,6]. Rhizomucor miehei FCH 116.3 từ Bảo tồn gen Vi sinh vật Công nghiệp có khả năng  chịu được nhiệt độ cao và chịu được pH thấp, phù hợp với những điều kiện của dịch hèm thải của nhà máy, đồng thời cũng phù hợp làm đối tượng nghiên cứu trương tự các chủng nấm sợi khác  làm thức ăn cho vật nuôi [8]. Do đó, nghiên cứu hướng tới giải pháp khai thác tiềm năng sử dụng dịch hèm nhà máy rượu cồn từ sắn, ngô làm môi trường lên men thử nghiệm chủng Rhizomucor miehei FCH 116.3.

Mục tiêu nghiên cứu công nghệ lên men nấm sợi và khai thác tiềm năng ứng dụng của dịch hèm lỏng nhà máy cồn nhiên liệu Tùng Lâm. Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát và lựa chọn thiết bị lên men khí nâng cho quy trình lên men nấm sợi nhờ những ưu điểm hơn hệ thống lên men cánh khuấy như ít tiêu tốn năng lượng và giảm sự đứt gãy hệ sợi, hạn chế tạp nhiễm.

Chủng Rhizomucor miehei FCH 116.3 chịu nhiệt độ cao, chịu pH thấp được tiếp nhận từ Bảo tồn gen Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm.

Môi trường lên men: dịch hèm sắn lỏng từ nhà máy sản xuất cồn Tùng Lâm. Dịch hèm được chuyển từ nhà máy và được ly tâm thu dịch lỏng. Dịch lỏng hèm sắn có pH thấp (pH4.2) và hàm lượng chất khô 7,2% và nồng độ chất tan cao (Bx 5-7), nồng độ đường khử tổng 3,5 g/L được sử dụng trực tiếp làm môi trường cho lên men trong thí nghiệm.

Thiết bị lên men được sản xuất trong nước theo yêu cầu đặt hàng của nhiệm vụ nghiên cứu có thể tích thiết bị 10L (thể tích thực lên men 7L), hình trụ thẳng đứng cao 52cm, bán kính 8cm, trụ rỗng bên trong cao 21cm và bán kính 5cm. Hệ thống điều khiển tự động Jupiter của hãng hãng Solaris Biotechnology, Italy có khả năng điều khiển và ghi nhận tự động các thông số quá trình lên men như nhiệt độ, pH, oxy hòa tan. 

Chủng được nuôi trên môi trường PDA, sau 3 ngày sẽ thu bào từ cấp giống mật độ 106 bào tử/mL vào thiết bị lên men có chứa 7 lít môi trường lên men dịch hèm lỏng. Dịch hèm lỏng sau ly tâm tách bã được sử dụng trực tiếp làm dịch lên men, thanh trùng 100°C/ 30 phút và để nguội về nhiệt độ phòng. Quá trình lên men được thực hiện ở 45°C, sục khí 2-6 lpm (tương ứng 0,3-0,9 v/v/m), trong thời gian 4 ngày. Trong quá trình lên men duy trì tốc độ sục khí 2-3lpm (0,3 v/v/m) và mỗi 24h sẽ tiến hành thay đổi tốc độ sục khí từ 2lpm tới tối đa 6-7lpm để đo vận tốc dòng chảy và tăng khả năng đảo trộn, pH và nồng độ oxy hòa tan được thu nhận và theo dõi trong quá trình lên men.

Mẫu lấy tại các thời điểm khảo sát là 50mL và bảo quản -20°C cho tới khi phân tích. Hệ thống điều khiển sử dụng của hãng Solaris Biotechnology, Italy, điều khiển quá trình tự động sử dụng quy trình điều khiển LEONARDO.

Các cảm biến phân tích vận tốc chất lỏng hiện nay hầu hết được thiết kế phù hợp cho chất lỏng đồng nhất, tuy nhiên trong thí nghiệm này các cảm biến sử dụng ống hoặc cánh khuấy chuyển động đều có khả năng bị tắc cục bộ khi dòng chảy có sinh khối nấm sợi phát triển và kết đám [2,3]. Do đó, để mô phỏng sự di chuyển của hệ sợi trong thiết bị và phân tích chúng tôi đưa vào thiết bị các vật thể đánh dấu được mô phỏng tương đương theo hình dạng và tỷ trọng của hệ sợi (sợi cellulose có kích thước 0,5-1,0 mm bề dày, chiều dài 10-20mm) và đánh dấu các vị trí cố định trên thành thiết bị lên men các để đo thời gian thực đi hết một vòng lặp và tốc độ dòng chảy trung bình. Các thông số được phân tích lặp lại 8-10 lần để có giá trị trung bình chính xác [4].

Sinh khối khô tế bào được xác định theo phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi, 50mL dịch được lấy mẫu sau đó lọc rửa sinh khối qua giấy lọc, sấy đến khối lượng không đổi và xác định khối lượng.

Nồng độ chất tan Brix của mẫu lên men được phân tích bằng thiết bị phân tích nồng độ Bx điện tử (Scientific., Hoa Kỳ).

Trong giá trị khảo sát, khi tốc độ sục khí tăng, vận tốc dòng chảy tăng, ở tốc độ sục khí lớn hơn 5lpm vận tốc dòng chảy không tăng thêm khi tăng tốc độ sục khí, điều này có thể giả thiết do sự xuất hiện dòng chảy rối [4]. Rõ ràng sự ảnh hưởng của tốc độ sục khí tới vận tốc dòng chảy phụ thuộc vào dạng dòng chảy và đặc tính chất lỏng trong thiết bị (tỷ trọng, độ nhớt). Hệ dòng chảy trong trường hợp này là hỗn pha gồm các bọt khí và dòng chất lỏng. Hệ dòng chảy này sẽ trở nên phức tạp hơn nữa khi có mặt sự phát triển của sinh khối tế bào, là các vật thể rắn kích thước dạng sợi và thậm chí còn thay đổi kích thước theo thời gian.

Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên thời gian và vận tốc dòng chảy được trình bày trong Hình 3.

Đối với dịch hèm sắn, có sự giảm tốc độ dòng chảy so với nước ở cùng tốc độ sục khí do dịch hèm sắn có nồng độ chất tan và độ nhớt cao hơn nước. Tại thời điểm ngày đầu tiên (0-24h) không có sự khác biệt về vận tốc dòng chảy do kích thước của hệ sợi chưa đạt đến mức độ cản trở dòng chảy. Tại thời điểm ngày thứ 2 (48h), lúc này dòng chảy đã bị cản trở và chậm hơn rõ rệt. Tại thời điểm ngày 3 và ngày 4 (72-96h), dòng chảy đã bị cản trở đến mức độ tốc độ sục khí không đạt được tối đa như ngày đầu tiên (Hình 3).

Điều này thể hiện trong quá trình lên men vi nấm sử dụng sục khí làm tác nhân vận chuyển dòng chất lỏng, sự thay đổi về số lượng và kích thước hệ sợi đều ảnh hưởng đến vận tốc dòng chảy. Khi số lượng và kích thước tăng sẽ làm khó khăn cho vận chuyển và xuất hiện nhiều hơn các dòng chảy rối trong canh trường nuôi cấy. Điều này có thể dễ dàng quan sát được trong sự thay đổi về hình thái hệ sợi trong lên men (Hình 6).

Nồng độ oxy hòa tan duy trì được mức độ tiêu thụ cao trong suốt thời gian lên men tuy nhiên có thể thấy sự tiêu thụ lớn nhất vào giai đoạn đầu phát triển, sau đó sẽ giảm dần mức độ tiêu thụ, thể hiện ở tốc độ giảm dO2 chậm dần sau mỗi lần sục khí tối đa (Hình 4.). Tương ứng tốc độ tăng sinh khối ổn định theo thời gian trong 3 ngày đầu và giảm vào ngày thứ 4. Sinh khối thu nhận được đạt 26,7 g/L tương ứng với 4,2 g/L sinh khối khô sau 4 ngày lên men (Hình 5.).

Nghiên cứu bước đầu khảo sát quá trình lên men nấm sợi trên thiết bị lên men khí nâng và đã đánh giá được ảnh hưởng của tốc độ sục khí ảnh hưởng lên vận tốc dòng chảy. Kết quả cũng cho thấy sự giảm vận tốc dòng chảy khi sự phát triển của sinh khối hệ sợi đạt ngưỡng cản trở nhất định (ngày thứ 2 lên men).

Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy trên đối tượng nấm sợi và dịch hèm thải nhà máy có vai trò ý nghĩa lớn trong nghiên cứu xử lý dịch hèm thải nhà máy cồn cũng như công nghệ lên men nấm sợi

1. D. T. Erickson. (2012). Pilot-scale submersed cultivation of R. microsporus var. oligosporus in thin stillage, a dry-grind corn-to-ethanol co-product, (Doctoral dissertation, Iowa State University).

2. Frenzel, F., Grothey, H., Habersetzer, C., Hiatt, M., Hogrefe, W., Kirchner, M., ... & Mutongo, T. (2011). Industrial flow measurement basics and practice. ABB automation products Gmbh, 290.

3. Kiese, S., Ebner, H. G., & Onken, U. (1980). A simple laboratory airlift fermentor. Biotechnology Letters,2(8), 345-350.

4. Gavrilescu, M., & Tudose, R. Z. (1997). Mixing studies in external-loop airlift reactors. Chemical Engineering Journal,66(2), 97-104.

5. M. Musoni, J. Destain, P. Thonart, J. B. Bahama, and F. Delvigne, (2015), “Bioreactor design and implementation strategies for the cultivation of filamentous fungi and the production of fungal metabolites: From traditional methods to engineered systems,” Biotechnology, Agronomy and Society and Environment, vol. 19, no. 4. pp. 430–442.

6. M. Y. Chisti, B. Halard, and M. Moo-Young, “Liquid circulation in airlift reactors,” Chem. Eng. Sci., vol. 43, no. 3, pp. 451–457, 1988.

7. P. F. Stanbury, A. Whitaker, and S. J. Hall, (2013), Principles of Fermentation Technology. Elsevier Science.

8. S. F. S. Reihani and K. Khosravi-Darani, (2019), “Influencing factors on single-cell protein production by submerged fermentation: A review,” Electron. J. Biotechnol., vol. 37, pp. 34–40.

9. Ugalde, U. O., & Castrillo, J. I. (2002). Single cell proteins from fungi and yeasts. In Applied mycology and biotechnology (Vol. 2, pp. 123-149). Elsevier.

(Nguồn: Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Số 49 - Tháng 9/2022)​