Theo TS. Nguyễn Thị Phương Hòa - chủ nhiệm đề tài, Tagitinin C 1 (TC) là một thành viên nổi bật của họ germanocranolide, được xác định là một hợp chất sesquiterpene lactone chính của lá cây Cúc Quỳ (Tithonia diversifolia) và có hoạt tính chống ung thư cao. Tagitinin C có nhiều tiềm năng về dược chất như tác nhân ngăn ngừa ung thư, chống viêm, chống ký sinh trùng, chống ung thư và chống sốt rét. 

Vinblastin (Vin) là một trong những loại thuốc được sử dụng để hóa trị. Nó là một indole alkaloid thu được từ cây dừa cạn Madagasca, Catharanthus roseus (Họ Apocynaceae), trước đây được gọi là Vinca rosea L. Vinblastin được sử dụng như một loại thuốc hóa trị cho bệnh Hodgkin và các bệnh ung thư khác nhau như ung thư buồng trứng, ung thư hạch không Hodgkin, ung thư vú, ung thư đầu và cổ, sarcoma Kaposi, ung thư tế bào thận và ung thư tinh hoàn. Vinblastin có giá trị kinh tế cao và đắt tiền, tuy nhiên sản xuất hạn chế với số lượng ít.

Còn chấm lượng tử graphene (GQDs) là các khối graphene với kích thước ngang hai chiều (2D) (dưới 100 nm) có các đặc tính hóa học, vật lý và sinh học tuyệt vời. GQDs chỉ bao gồm một lớp nguyên tử nguyên tử cacbon. Tuy nhiên, hầu hết các GQD được tổng hợp cũng chứa các nhóm chức như oxygen, hydrogen và có nhiều lớp nguyên tử với kích thước khoảng 10nm. Do kích thước nhỏ, GQDs có triển vọng tốt hơn trong các ứng dụng y sinh so với graphene hoặc graphene oxide (GO). 

Là một thành viên của họ graphene và vật liệu nano dựa trên carbon, GQD có một số lợi thế so với các hạt nano khác trong ứng dụng phân phối thuốc do độc tính thấp, tỷ lệ bề mặt/thể tích lớn và khả năng chức năng hóa bề mặt lớn. Khi so sánh với các dạng nanoplatform truyền thống khác, chẳng hạn như polyethylene glycol (PEG), GQD có thể cung cấp nhiều vị trí liên kết hơn để liên hợp hóa trị liệu và cải thiện khả năng hấp thụ của tế bào.

Từ những khảo sát và đánh giá trên, Phòng TNTĐ Công nghệ lọc, hóa dầu quyết định lựa chọn các nguyên liệu để nguyên cứu bao gồm: Chấm lượng tử graphene (GQDs), Vinblasttine sulfate (Vin) được mua từ sigmaaldrich. Arginine-glycine-aspartic acid (RGD), 1- (3-9dimethyamino) propryl-3-ethylcarbodiimide (EDC) và N-hydroxysuccinmide (NHS) đã được mua từ Sino-Pharm Chemical Reagent Co., Ltd, Trung Quốc. Cùng các thuốc thử khác có bán trên thị trường từ Acros, Aldrich, Alfa Aesar, TCI,... và được sử dụng mà không cần tinh chế thêm.

Thông qua việc kết hợp đồng bộ nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong suốt 3 năm (từ tháng 7/2018 - 7/2021), nhóm thực hiện đề tài đã thu được các kết quả nổi bật như sau:

Nhóm thực hiện đề tài đã chế tạo thành công GQDs bởi phương pháp Hummer cải tiến, có sử dụng H₂O₂, H₂SO₄ và KMnO₄ ở nhiệt độ 80^oC trong vòng 8h. Sản phẩm GQDs tạo ra có kích thước trong khoảng 5nm đến 20 nm và phát huỳnh quang màu xanh lam khi chiếu tia UV. Cường độ huỳnh quang của GQDs mạnh nhất ở 486 nm khi kích hoạt bước sóng kích thích ở 355nm. Nồng độ của GQDs phân tán trong nước là 0,2 mg/mL. Sản phẩm GQDs tạo ra đạt tiêu chuẩn sử dụng trong y học, có độc tính với một số tế bào ung thư như tế bào ung thư dạ dày ở người (HGC-27), tế bào ung thư phổi ở người (A549) và đặc biệt không có độc tính đối với tế bào thường (vero).

Đồng thời, đã biến tính thành công GQDs bằng cách carboxyl hóa GQDs và chức hóa GQDs bởi diamine tạo ra bề mặt phù hợp với việc mang các hoạt chất là các dẫn xuất của Vinblastin và Tagitinin C. Theo đó GQDs được carboxyl hóa bằng phương pháp siêu âm sử dụng NaOH và ClCH2COOH trong môi trường có chứa chất xúc tác DMAP và DCC. GQDs cũng được chức hóa thành công bởi 2,2’-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) trong môi trường butanol ở nhiệt độ 90°C trong 8 giờ.

Nhóm cũng thành công trong việc gắn các tác nhân hướng đích lên trên bề mặt của GQDs. GQDs đã được gắn tác nhân hướng đích Arginine-glycine-aspartic acid (RGD), sử dụng xúc tác 1- (3-9dimethyamino) propryl-3-ethylcarbodiimide (EDC) và N-hydroxysuccinmide (NHS) tại nhiệt độ phòng, trong 3 giờ.

Phòng TNTĐ Công nghệ lọc, hóa dầu đã gắn thành công Vinblastine lên trên bề mặt của GQDs với các tỷ lệ khối lượng giữa GQDs:Vin khác nhau (1:1, 1:3 và 1:5 (wt/wt)). Sự có mặt của Vinblastine trên bề mặt GQDs đã được chứng minh bằng các phương pháp phổ UV-vis, phổ huỳnh quang, và phổ hồng ngoại. Hàm lượng Vin được gắn lên GQDs trong tổ hợp GQDs-Vin 1:1, 1:3 và 1:5 lần lượt là 0.849 mg/mg (93.40 %w/w), 2.194 mg/mg (95.06 %w/w) and 3.175 mg/mg (95.26 %w/w). Kết quả TEM cũng cho thấy, khi làm lượng Vinblastine tăng, đường kính của hạt GQDs-Vin cũng tăng lên. Cụ thể trong đường kính của GQDs-Vin (1:1) và GQDs-Vin (1:3) trong khoảng từ 50-70 nm và 100-150 nm, tương ứng. Đặc biệt đường kính của hạt nano GQDs-Vin (1:5) tăng đáng kể với kích thước lên đến khoảng 500nm.

Bên cạnh đó, gắn thành công Vinblastine lên bề mặt GQDs biến tính (GQDs sau khi gắn tác nhân hướng đích RGD) (GQDsM-Vin). Các kết quả trong phổ UV-vis, phổ huỳnh quang và phổ hồng ngoại đều chỉ ra sự có mặt của Vinblastine trên bề mặt của GQDs biến tính.

 

TS. Nguyễn Thị Phương Hòa cùng các cộng sự đã nghiên cứu quá trình chiết xuất và phân lập Tagitinin C từ T. diversifolia bằng phương pháp chiết xuất nhanh sử dụng dung môi là dichloromethane. Cấu trúc của Tagitinin C phân lập được xác nhận bằng các phương pháp phân tích hóa lý như FTIR, 1H-NMR, 13C-NMR (COZY, HSQC, HMBC) và phương pháp khối phổ ESI. Dữ liệu phân tích này giống với dữ liệu được báo cáo trong tài liệu. Độ tinh khiết 97% của Tagitinin C được đo bằng phân tích HPLC.

Đã thành công điều chế các dẫn xuất của Tagitinin C bằng phản ứng cộng Michael. Và lần đầu tiên đưa ra được điều kiện phản ứng hơn 40 tổ hợp các dẫn xuất khác nhau của Tagitinin C đã được tổng hợp thành công với độ chọn lọc vị trí, nhóm chức và lập thể cao của amin, photphonat và thiols vào Tagitinin C. Sử dụng amin bậc 1, photphonat hoặc thiol, chỉ cho các dẫn xuất cộng Michael bổ sung vào nhóm keton α, β-không bão hoà đã được quan sát thấy, trong khi amin bậc 2 phản ứng trên cấu trúc nhóm α-metylen-γ-lacton của Tagitinin C.

Đã nghiên cứu điều chế tổ hợp dẫn xuất Tagitinin C/GQDs biến tính. Kết quả chỉ ra rằng Tagitinin C không thể gắn lên trên bề mặt của graphene bằng cách sử dụng một phương pháp trộn hợp đồng nhất đơn giản. Tagitinin C chỉ được được gắn lên trên bề mặt của graphene sau khi biến tính GQDs bằng cách carboxyl hoặc chức hóa bề mặt của graphene sử dụng ClCH2COOH và diamine tương ứng.

Nhóm thực hiện đề tài đã hoàn thiện và thử nghiệm tính ổn định của quy trình điều chế GQDs. Sản phẩm GQDs tạo ra đều có kích thước nhỏ hơn 20 nm và phát huỳnh quang màu xanh lam khi chiếu tia UV. GQDs tạo ra từ quy trình đều có độc tính với một số tế bào ung thư như tế bào ung thư dạ dày ở người (HGC-27), tế bào ung thư phổi ở người (A549) và đặc biệt không có độc tính đối với tế bào thường (vero), đạt tiêu chuẩn sử dụng trong y học. Sản phẩm thu được khoảng 3200 ml GQDs đã được tổng hợp với nồng độ phân tán trong nước là 0,2 mg/mL.

Cũng như thử nghiệm tính ổn định của một số quy trình gồm: quy trình điều chế tổ hợp dẫn xuất Vinblastine/GQDs biến tính (tổ hợp dẫn xuất GQDsM-Vin). Sản phẩm tạo ra được xác định bằng phương pháp phổ UV-vis, phổ huỳnh quang và phổ hồng ngoại, cho thấy sự có mặt của Vinblastine trên bề mặt GQDs. 105g chế phẩm tổ hợp dẫn xuất GQDsM-Vin đã được điều chế và thử nghiệm hiệu quả kháng ung thư invitro và thử độc tính invivo; quy trình điều chế dẫn xuất Tagitinin C. Sản phẩm dẫn xuất tạo ra được xác định bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ MNR. 210g dẫn xuất của Tagitinin C với amin đã được điều chế thành công; quy trình điều chế tổ hợp dẫn xuất Tagitinin C/GQDs biến tính. Phổ UV-vis, phổ huỳnh quang và phổ hồng ngoại được dùng để xác định sự có mặt của Tagitinin C trên bề mặt của GQDs. 110g chế phẩm dẫn xuất của Tagtinin C/GQDs đã được tổng hợp để sử dụng làm đối tượng thử nghiệm hiệu quả kháng ung thư invitro.

Từ đó, thử nghiệm hiệu quả kháng ung thư invitro của các dẫn xuất và tổ hợp tổng hợp được trên các dòng tế bào ung thư khác nhau Hela (Tế bào ung thư cổ tử cung), A549 (Tế bào ung thư phổi ở người), MCF-7 (Tế bào ung thư vú ở người) và CCF-STTG1 (Tế bào ung thư não ở người), MIA PaCa-2 (ung thư tuyến tụy), và tế bào thường (Vero, HEK 293).

Từ kết quả invitro cho thấy, khả năng diệt tế bào ung thư của các tổ hợp GQDs-Vin lớn hơn 90% đối với các tế bào ung thư Hela (Tế bào ung thư cổ tử cung), A549 (Tế bào biểu mô tế bào ung thư biểu mô phổi ở người), MCF-7 (Tế bào ung thư biểu mô vú ở người) và CCF-STTG1 (U tế bào biểu mô não người). Độc tính đối với tế bào ung thư của tổ hợp GQDs-Vin đối với các tế bào ung thư này cao hơn nhiều so với Vinblastine và GQDs riêng lẻ.

Điều này tương ứng với IC₅₀ của vật liệu tổng hợp GQDs-Vin thấp hơn so với Vin và GQDs riêng lẻ đối với các tế bào ung thư này. Hơn nữa, Vinblastine không có độc tính với tế bào ung thư biểu mô dạ dày ở người (HGC-27), nhưng độc tính các tổ hợp dẫn xuất GQDs-Vin tương đương với GQDs (tức giá trị IC₅₀ của các vật liệu tổ hợp này tương đương với giá trị IC₅₀ của GQDs. Điều này có thể chỉ ra tác dụng hiệp đồng của các chấm lượng tử vinblastine và graphene trong vật liệu tổng hợp của chúng đối với tế bào chống ung thư. 

Ngoài ra, một điều đặc biệt sự kết hợp của Vinblastine và GQDs trong tổ hợp dẫn xuất GQDs-Vin làm giảm hoạt tính gây độc đối với tế bào thường (vero) so với Vin ban đầu. Kết quả cho thấy, giá trị IC₅₀ của Vinblastine là 0,05 µg/ml đối với tế bào thường, trong khi giá trị IC₅₀ tương ứng của tổ hợp dẫn xuất GQDs-Vin tăng lên đạt 0,17 µg/ml.

Độc tính của tổ hợp dẫn xuất GQDsM-Vin đối với các tế bào ung thư dạ dày ở người (HGC-27) và tế bào ung thư phổi ở người (A549) cũng tăng đáng kể so với Vinblastin và GQDs riêng lẻ. Kết quả cho thấy giá trị IC₅₀ của dẫn xuất tổ hợp GQDsM-Vin thấp hơn rất nhiều so với giá trị IC₅₀ của Vinbalstin và GQDs riêng lẻ. Đặc biệt, tổ hợp dẫn xuất GQDsM-Vin thể hiện độc tính tế bào cao nhất đối với tế bào A549 với giá trị IC₅₀ là 1,57 ng/ml, thấp hơn ít nhất ≈ 6,3 lần so với giá trị IC₅₀ của Vin (9,91ng/ml), và thấp hơn rất nhiều lần so với giá trị IC₅₀ của GQDs (44,11 µg/ml). Vì vậy, GQDsM-Vin là tổ hợp dẫn xuất được chọn để thử nghiệm invivo trên chuột.

Mặc dù, các dẫn xuất mới của Tagitinin C không thể cải thiện đáng kể độc tính đối với các tế bào ung thư so với Tagitinin C, nhưng khả năng diệt tế bào ung thư MiaPaCa-2 của các dẫn xuất này cũng lên tới 90,2 %đến 99,5%. Và điều đặc biệt, các dẫn xuất này lại giảm độc tính đối với tế bào thường. Hơn nữa, dẫn xuất Michael của alcohol- amin và Tagitinin C thể hiện khả năng hòa tan được tăng cường trong nước có thể cải thiện sinh khả dụng và/hoặc cấu hình dược lý của chúng.

​

Hoạt tính sinh học của các vật liệu tổng hợp này cũng đã được thử nghiệm để so sánh với Tagitinin C. Graphenes (chấm lượng tử graphene và graphene oxit) không cải thiện bất kỳ độc tính tế bào nào của Tagitinin C trong vật liệu tổng hợp Tagitinin C-graphene, tuy nhiên nó làm giảm đáng kể độc tính của Tagitinin C đối với tế bào thường. Đặc biệt sau khi gắn Tagitinin C lên trên bề mặt của graphene tạo ra một tổ hợp mới có hoạt tính sinh học cao hơn so với Paclitaxel (sản phẩm đã được thương mại hóa) đối với tế bào ung thư, nhưng lại hoàn toàn lành tính đối với tế bào thường.

Độc tính cấp (LD50) trên chuột nhắt trắng: Biểu hiện độc tính của cả hai mẫu thử đều giống nhau, gồm: đi ngoài phân lỏng, chán ăn, giảm hoạt động vận động, giảm cân, xù lông. Chuột thường chết sau 3-7 ngày tiêm thuốc. Các biểu hiện độc tính giảm dần ở những chuột còn sống trong thời gian quan sát 7-14 ngày.

Độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng: Các chỉ số huyết học (hồng cầu, huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) giảm nhẹ, hoạt độ các enzym AST, ALT tăng nhẹ. Các chỉ số Albumin huyết tương, Cholesterol toàn phần, Creatinin máu bình thường. Trọng lượng gan và lách tăng nhẹ, trọng lượng tinh hoàn giảm nhẹ. Các chỉ số huyết học (hồng cầu, huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) giảm, hoạt độ các enzym AST, ALT tăng. Albumin huyết tương giảm nhẹ, Creatinin máu tăng nhẹ. Cholesterol toàn phần trong máu bình thường. Trọng lượng gan và lách tăng, trọng lượng tinh hoàn giảm.

Ngoài ra, đề tài đã thử nghiệm và đánh giá hiệu quả điều trị ung thư invivo của chế phẩm GQDsM-Vin trên chuột NOD-scid được cấy ghép tế bào ung thư phổi người A549 và gây khối u thành công, GQDs-M-Vin tiêm tĩnh mạch 2µg/100 µL PBS/chuột một lần duy nhất đã thể hiện tác dụng ức chế sự phát triển khối u, làm thể tích khối u nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng tiêm PBS tại các thời điểm sau tiêm thuốc 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần. Tác dụng ức chế sự phát triển khối u của GQDs-M-Vin có xu hướng tốt hơn so với thuốc tham chiếu Vinblastin, thể hiện: Thuốc tham chiếu Vinblastin tiêm tĩnh mạch 2µg/100 µL PBS/chuột một lần duy nhất cũng làm thể tích trung bình khối u nhỏ hơn so với lô chứng nhưng khác biệt chỉ có ý nghĩa thống kê tại các thời điểm sau tiêm thuốc 2 tuần và 3 tuần. 

Tại tất cả các thời điểm sau tiêm thuốc 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần, lô chuột tiêm GQDs-M-Vin đều có thể tích trung bình khối u nhỏ hơn so với lô chuột tiêm Vinblastin và lô chứng. Và sau thời điểm tiêm thuốc 4 tuần thể tích khối u điều trị bằng thuốc GQDsM-Vin đạt 440,96 mm³, trong khi thể tích khối u tương ứng của lô chúng là 1479,46 mm³, cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của khối u của tổ hợp dẫn xuất GQDsM-Vin đạt 29,81%. GQDs-M-Vin cũng như Vinblastin tiêm tĩnh mạch 2µg/100 µL PBS/chuột một lần duy nhất không gây ảnh hưởng đến số lượng tế bào NK, tỷ lệ tế bào Macrophage và số lượng tế bào DC cells trong lách và gan chuột mang tế bào ung thư phổi người A549.