Sim (Rhodomyrtus tomentosa) chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng. Trong đó, polyphenol và vitamin C là các hợp chất được được ứng dụng nhiều trong thực phẩm, dược phẩm và y học. Nghiên cứu tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly polyphenol và vitamin C từ quả sim bằng phương pháp sử dụng chế phẩm pectinase. Điều kiện trích ly bao gồm 4 yếu tố được khảo sát bằng thực nghiệm là tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, nồng độ chế phẩm, nhiệt độ và thời gian xử lý. Các thông số thích hợp cho quá trình trích ly polyphenol và vitamin C bằng phương pháp này là tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 (w/v), nồng độ chế phẩm pectinase là 0.1 (v/w), nhiệt độ xử lý là 40oC và thời gian xử lý là 60 phút.

Từ khóa: polyphenol, vitamin C, trích ly, quả sim, chế phẩm pectinase.

Sim (Rhodomyrtus tomentosa), một loài thực vật có hoa thuộc họ Myrtaceae, có nguồn gốc ở miền Nam và Đông Nam châu Á [1]. Trong nghiên  cứu  gần  đây, 19 hợp chất  phenolic đặc trưng  của  quả  sim đã được xác định [2]. Các hợp chất phenolic chính có trong quả sim bao gồm ellagitannin, stillben, anthocyanin, flavonol và acid phenolic. Chúng là các chất có hoạt tính chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm và chống béo phì. Polyphenol là những hợp chất thơm chứa nhóm hydroxyl đính trực tiếp với nhân benzene, có nhiều trong thực vật và được công nhận là một trong những nhóm chất chuyển hóa thứ cấp lớn nhất và phổ biến nhất với các đặc tính chống oxy hóa rõ rệt.

Về y học polyphenol là một trong những hợp chất tự nhiên có nhiều tác dụng như kháng viêm, kháng khuẩn, chống dị ứng, chống lão hóa và một số bệnh tật liên quan đến ung thư [3]. Ngoài ra, trong sim cũng chứa một lượng đáng kể vitamin C. Vitamin C là hợp chất hữu cơ tự nhiên có khả năng chống oxy hóa và được tạo thành do sự chuyển hóa của các glucose với sự có mặt của các enzyme xúc tác đặc trưng. Vitamin C có dạng tinh thể trắng, dễ tan trong nước, không tan được trong ether, clorofom và dung môi hữu cơ. Vitamin C là một chất dinh dưỡng thiết yếu cho các loài động vật bậc cao và cho một số ít các loài khác. Nó đóng vai trò quan trọng trong phòng chống lão hóa mắt và đục thủy tinh thể, tăng cường hệ miễn dịch, cải thiện làn da móng tay và mái tóc [4].

Tại Việt Nam, sim ngoài việc được ứng dụng để làm bánh, mứt, kẹo dẻo và rượu bổ còn được sử dụng để làm thuốc chữa  bệnh [5].  

Tuy quả sim mang lại nhiều lợi ích như vậy nhưng sản lượng cùng giá trị sinh học của quả sim vẫn còn chưa được khai thác triệt để. Bằng chứng là, sản lượng sim vẫn chưa được thống kê cụ thể do diện tích mọc dại còn nhiều. Thêm vào đó, các công trình nghiên cứu về việc trích ly các hợp chất polyphenol và vitamin C trong quả sim vẫn còn hạn chế [6]. Nghiên cứu này sử dụng chế phẩm enzyme pectinase để tăng hiệu quả quá trình trích ly polyphenol và vitamin C từ quả sim. Từ đó, giá trị quả sim sẽ được cải thiện và được quan tâm ứng dụng nhiều hơn trong thực phẩm cũng như trong y học.

Quả sim được thu hái tại Đà Nẵng. Tại phòng thí nghiệm, quả sim được phân loại, loại bỏ tạp chất, rửa sạch, để ráo, xay nhỏ và bảo quản lạnh đông.

Chất xúc tác sinh học và hóa chất: Enzyme Pectinex Ultra Tropical (Đan Mạch), Acid gallic (Đức), Folin - Ciocalteu (Đức), Na2CO­3 (Trung Quốc), KI (Trung Quốc), KIO3 (Trung Quốc), HCl (Việt Nam), Hồ tinh bột (Việt Nam)

Cân 5g sim, bổ sung dung môi là nước cất với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi khảo sát: 1/5, 1/10, 1/15, 1/20, 1/25 (w/v); chế phẩm pectinase được bổ sung theo các nồng độ: 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 (v/w); với các nhiệt độ trích ly: 30, 40, 50, 60, 70 (oC); tại các khoảng thời gian lần lượt là: 30, 60, 90, 120, 150 (phút) và trong điều kiện hạn chế sự tác động của ánh sáng và không khí. Dịch sau khi trích ly được cho qua vải lọc, định mức đến 200ml trong bình tam giác. Sau đó đem xác định hàm lượng polyphenol tổng và hàm lượng vitamin C. Từ đó, chọn được các kiện kiện thích hợp cho quá trình trích ly.

Hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocal-teu [7]. Nguyên lý của phương pháp dựa vào phản ứng oxi hóa của các hợp chất polyphenol bằng thuốc thử Folin – Ciocalteu tạo thành sản phẩm có màu xanh sẫm. Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ polyphenol trong một phạm vi nhất định. Sau khi phản ứng kết thúc, đem đo độ hấp thụ màu ở λ = 765 nm và dựa vào đồ thị đường chuẩn của axit galic để xác định hàm lượng polyphenol. Hàm lượngolyphenol được xác định theo công thức sau:

Trong đó:

X       : Hàm lượng polyphenol (mg GAE/g sim)

OD    : Giá trị mật độ quang của mẫu dịch sim sau khi đã trừ đi độ màu của dung dịch

V       : Tổng thể tích dịch sau khi định mức (ml)

m       : Khối lượng mẫu chiết (g)

a, b    : Hệ số từ phương trình đường chuẩn acid gallic y = 0.0125x + 0.0134

Hàm lượng vitamin C được xác định theo phương pháp chuẩn độ của tác giả Outreach [8]. Nguyên lý dựa trên quá trình phản ứng oxy hóa khử của vitamin C với kali iodat khi có mặt hồ tinh bột. Khi cho ion iotat (IO3−) vào dung dịch axit có chứa ion iotua (I−). Trong phản ứng này, iốt được tạo thành ngay lập tức bị khử thành iotua miễn là có bất kỳ acid ascorbic nào. Khi tất cả acid ascorbic đã bị oxy hóa, iốt dư sẽ phản ứng với chất chỉ thị tinh bột, tạo thành phức chất iốt - tinh bột màu xanh đen. Đây là điểm cuối của quá trình chuẩn độ. Hàm lượng vitamin C (mg/100g sim) được xác định theo công thức sau:

Trong đó:

X       : Hàm lượng vitamin C (mg/100g)

V       : Thể tích KIO3 chuẩn độ (ml)

V1       : Tổng thể tích dịch sau khi định mức (ml)

V2       : Thể tích đem đi chuẩn độ (ml)

m       : Khối lượng mẫu chiết (g).

1.056 : Hệ số chuyển đổi từ phản ứng oxy hóa vitamin C

Nghiên cứu  tiến hành 3 lần lặp lại đối với mỗi thí nghiệm. Kết quả thu được trình bày là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.

Để đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu thí nghiệm, chúng tôi xử lý các kết quả bằng phương pháp thống kê ANOVA (α = 5%) trên phần mềm Statgraphic XIV.

Kết quả ở đồ thị Hình 1 cho thấy hàm lượng polyphenol, vitamin C đều cao nhất ở tỷ lệ 1/20 lần lượt với giá trị 23.413 ± 0.229 mgGAE/g và 3.283 ± 0.259 mg/100g, sau đó hàm lượng hai chất này giảm dần ở tỷ lệ 1/25 và 1/30. So với tỷ lệ 1/20, ở tỷ lệ 1/30, hàm lượng polyphenol thu được giảm đi 1,54 lần, hàm lượng vitamin C giảm đi 1,29 lần. Nguyên nhân là do khi tỷ lệ dung môi quá nhỏ, không đủ áp suất thẩm thấu, không đủ khả năng tiếp xúc với nguyên liệu để thu được hiệu suất trích ly cao; còn khi tỷ lệ dung môi vừa đủ sẽ làm tăng độ thẩm thấu, tăng khả năng tiếp xúc với nguyên liệu dẫn đến tăng hiệu suất trích ly. Đến một thể tích nhất định, lượng hoạt chất được tách ra gần như hoàn toàn và không thể trích ly được nữa khi tăng tỷ lệ dung môi. Giá trị polyphenol và vitamin C đạt cực đại ở tỷ lệ 1/20. Theo Kossah lượng dung môi sử dụng càng nhiều thì lượng oxy hòa tan vào đó càng lớn, sự có mặt oxy không chỉ làm giảm hàm lượng mà còn làm suy yếu hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol [9]. Với mục tiêu thu được hàm lượng polyphenol, vitamin C cao nhất và tiết kiệm chi phí, tỷ lệ 1/20 được chọn là tỷ lệ trích ly thích hợp nhất.

Về nguyên tắc, với một lượng cơ chất xác định, khi nồng độ chế phẩm càng tăng thì hàm lượng các chất thu được càng tăng [10]. Kết quả ở Hình 2 cho thấy hàm lượng polyphenol và viamin C thu được cao nhất lần lượt là 24.302 ± 0.678 mgGAE/g và 3,343 ± 0.362 mg/100g tại nồng độ chế phẩm 0.1 (v/w). Nguyên nhân là do enzyme pectinase phá vỡ liên kết giữa pectin và cellulose của các tế bào và mô để giải phóng các chất hòa tan dẫn đến tăng hàm lượng thu được [11]. So với nồng độ chế phẩm là 0.1 (v/w), ở nồng độ 0.25 (v/w), hàm lượng polyphenol và vitamin C giảm lần lượt là 1,6 lần và 1,5 lần. Trước đây, Nhân Minh Trí và cộng sự (2013) đã tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất siro sim, kết quả cũng thu được nồng độ enzyme pectinase dao động trong khoảng 0.1 (v/w) đến 0.15 (v/w) sẽ cho lượng dịch quả cao nhất. Ứng với nồng độ pectinase tối ưu là 0,1 (v/w) thì hiệu suất thu hồi là 63,92% [12]. Với mục tiêu thu được hàm lượng polyphenol, vitamin C cao nhất và tiết kiệm chi phí, nồng độ chế phẩm pectinase 0.1 (v/w) được chọn là nồng độ thích hợp nhất.

Kết quả ở Hình 3 cho thấy hàm lượng polyphenol, vitamin C đều cao nhất ở 40oC lần lượt là 25.006 mg GAE/g sim và 3.582 mg/100g, sau đó giảm dần từ 50 - 70oC. So với nhiệt độ 40oC, ở nhiệt độ 70oC hàm lượng polyphenol giảm đi 1.61 lần và hàm lượng vitamin C giảm đi 1.5 lần. Nguyên nhân là do nhiệt độ cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của các hợp chất polyphenol và vitamin C; làm giảm độ nhớt của dung môi; cũng như tăng quá trình chuyển chất và sự thấm ướt của nguyên liệu chiết. Tuy nhiên khi nhiệt độ cao hơn 40oC thì hàm lượng hai chất này có xu hướng giảm là do nhiệt độ cao phá hủy một số nhóm chất chống oxy hóa không bền với nhiệt độ. Theo Simon và cộng sự (1990) khi tăng nhiệt độ chiết, các hợp chất polyphenol trong nguyên liệu bị phân hủy do các phản ứng thủy phân, oxy hóa nội tại và polymer hóa. Kết quả này cũng đồng nhất với kết quả nghiên cứu của Phan Thị Kiều Linh (2020) khi đánh giá hiệu quả của enzyme pectinase đến quá trình thu hồi dịch nho - dâu tằm [13]. Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình xử lý quả sim bằng enzyme pectinase là 40oC. 

Dịch trích ly ở thời gian 30 phút, 60 phút có hàm lượng polyphenol, vitamin C tăng dần và đạt cao nhất lần lượt là 26.31 (mg GAE/g sim) và 3.731 (mg/100g sim) tại 60 phút. Sau đó hàm lượng hai hàm mục tiêu giảm dần và giá trị thấp nhất thu được là tại 150 phút (Hình 4). Cụ thể là, sự thoái hóa các hợp chất trên so với thời điểm 60 phút là gần 30% và 35% đối với hàm lượng polyphenol, vitamin C. Thời gian đầu trích ly, do chênh lệch nồng độ giữa dung môi và cơ chất thúc đẩy quá trình khuếch tán xảy ra mãnh liệt dẫn đến sự gia tăng hàm lượng chất chiết ra khỏi tế bào. Tuy nhiên, thời gian trích ly càng dài thì độ chênh lệch nồng độ các chất trong nguyên liệu và trong dung môi giảm dần đồng thời có sự cộng hưởng của nhiệt độ, sự oxy hóa do kéo dài tiếp xúc với ánh sáng và không khí là nguyên nhân làm hàm lượng cùng chất lượng polyphenol, vitamin C giảm. Quy luật này đồng nhất với kết quả nghiên cứu của Sagu và cộng sự (2014) khi dùng enzyme pectinase tối ưu hóa quá trình chiết xuất nước ép chuối [14]. Vì những nhận định trên thời gian thích hợp để xử lý quả sim với chế phẩm pectinase là 60 phút. 

Trong quả sim, hàm lượng polyphenol và vitamin C thu hồi được sau quá trình trích ly với sự hỗ trợ của enzyme pectinase thay đổi theo điều kiện khảo sát. Phương pháp này có hiệu quả rõ rệt đến quá trình thu nhận các hợp chất trên với dung môi là nước ở các điều kiện thích hợp để trích ly với enzyme pectinase là: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 (w/v), nồng độ chế phẩm 0.1 (v/w), ở nhiệt độ 40 (oC), thời gian 60 phút sẽ thu được các chất với hiệu suất cao. Cụ thể là, hàm lượng polyphenol thu được 26.31± 1.271 (mg GAE/g sim) và hàm lượng vitamin C thu được 3.731± 0.259 (mg/100g sim). Hiệu suất thu hồi đạt gần 55% đối với hàm lượng polyphenol và gần 25% đối với hàm lượng vitamin C.

1. Al-Farsi, M.A. and C.Y. Lee. (2008). Optimization of phenolics and dietary fibre extraction from date seeds. Food Chemistry, 108(3), 977-985.

2. Pham, M.T. (2014), Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tách chiết piceatannol trong quả sim và làm sạch dịch chiết. Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 78.

3. Liyana-Pathirana, C. and F. Shahidi. (2005). Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surface methodology. Food Chemistry, 93(1), 47-56.

4. Lưu Duẩn và Lê Doãn Diên (2002), Hóa sinh học công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

5. Tung, N.H., et al. (2009). New anthracene glycosides from Rhodomyrtus tomentosa stimulate osteoblastic differentiation of MC3T3-E1 cells. Archives of Pharmacal Research, 32(4), 515-520.

6. Yen, H.T., et al. (2015). Optimization of extraction of phenolic compounds that have high antioxidant activity from Rhodomyrtus tomentosa (ait.) Hassk.(sim) in chi linh, Hai Duong. Academia Journal of Biology, 37(4), 509-519.

7. Singleton, V.L. and J.A. Rossi. (1965). Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American journal of Enology and

8. Kalia, K., et al. (2008). Effects of extraction methods on phenolic contents and antioxidant activity in aerial parts of Potentilla atrosanguinea Lodd. and quantification of its phenolic constituents by RP-HPLC. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(21), 10129-10134.

9. Sattler, W., et al. (1989). The effect of enzyme concentration on the rate of the hydrolysis of cellulose. Biotechnology and Bioengineering, 33(10), 1221-1234.

10. Glennon, P., et al. (2011). SJK’s Upper School Summer Reading List 2011.

11. T. M. Nhân, T.M.N. (2013). Optimization of factors affecting syrup production from "sim" fruit (Rhodomyrtus tomentosa) for high anthocyanin concentration and good quality. Journal of Scientific Research and Development, 12(1), 98-107.

12. Phan, L.T.K. (2020), Đánh giá hiệu quả của enzyme pectinase đến quá trình thu hồi dịch nho - dâu tằm. Tạp chí Công Thương. Số 18 tháng 7/2020.

13. Sagu, S.T., et al. (2014). Optimisation of low temperature extraction of banana juice using commercial pectinase. Food Chemistry, 151, 182-190.